液相色谱，你问我答（十一）- 工业快报

液相色谱，你问我答（十一）

产业资讯 / 来源：工业快报 / 作者：工业快报 / 发布时间：2022-02-21

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关于梯度方法转移的Q&A

问：我开发的一个方法在我的系统上重复性非常好，但是在其他系统上就不一样了，怎么回事？

答：有时候换色谱系统时梯度方法会出现一些问题。除非系统完全一样，否则保留时间总有些变化。通常这个时间的变化都在分离度的范围之内，忽略它，方法还是可以用的。另外，如果适当了解潜在的原因，可以调节梯度在不同的色谱系统中得到相同的效果。

另一个涉及到这个问题的是梯度滞后体积。它是从梯度混合处到柱头的体积。当你进样开始分析后，梯度并没有到达柱头，还要等滞后体积排空后才到。这就是说样品在开始一段时间是等度迁移的。由于不同系统的滞后体积是不同的，所以保留时间就不一样了，有时候还是影响到分离度。

另一个原因是梯度本身，由系统与系统之间的组分差异导致。对于现在大部分的色谱厂家来说这个问题都不是很严重。但通常，在输送等比例的流动相时（50%A和50%B）精确度zui高，比例相差大时（5%A或95%A）精确度就会受损。

问：怎么才能知道我是哪种情况呢？

答：zui简单的做法是比较一下两个系统的梯度。卸掉柱子，接双通。（在梯度的B溶液后接紫外检测器）如果用的是反相色谱，可以在B溶液中加10mg/L的对羟基苯甲酸丙酯。两个系统都开始运行梯度，记录基线。然后比较一下两张图谱。要找到梯度开始的位置，测量梯度图谱。如果梯度是线性的，只要测量梯度的斜率就可以了。

很可能你会发现两台仪器的梯度开始时间不一样，图谱非常类似，梯度结束时间有一定的改变。这种情况就是说两台仪器的梯度滞后体积不一样。

问：如果是这种情况，有没有简单的方法抵消滞后体积的差异呢？

答：有一个办法大部分时候可以采用。如果新系统的梯度滞后体积小于转移前系统的体积，可以在梯度开始加一段等度。如果新系统滞后体积大，这种情况就比较困难。原则上你可以先开梯度，延后一段时间进样，这段时间要与两台仪器的滞后时间差一致。但在自动系统中就不能这么做，自动系统中是进样触发梯度开始的，这时候可能需要手动基线归零或重新开发方法。

问：在我花费时间开发方法后碰到这种情况可真不乐见啊，我以后该怎么做才能避免呢？

答：你可以在zui终使用的仪器上开发方法。这可能需要一些预见与计划，但通常还是可行的。你需要做的是了解新系统的性能，要知道系统的两个基本情况：梯度滞后体积和比例精确性。你可以在同一个实验里得到这两个数据：如前所述，在B溶液后加紫外检测器，设置一个多阶层的梯度，B溶液以5%的幅度从0%变到1oo%，流速与平常一样，应该是1mL/min吧。每段梯度大概保持5min。然后接双通运行梯度，记录图谱。每段梯度设置的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间。阶层的高度可以用来测量流动相比例。这些阶层可能有点模糊，那是由系统中混合体积造成的。

检测完系统，就可以按照它的性能来设计方法了。正如我前面提到的，zui大的问题是梯度滞后体积。如果你知道新仪器的滞后体积比开发方法的仪器大，就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别。如果目标系统滞后体积小，你就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间。

如果比例差别是在梯度运行中间出现的，相信你也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别。

这个讨论是假设柱子已经用初始流动相充分平衡了。有时我会遇到这样一些情况，在日常分析中，梯度变化很快，而柱子没有用初始流动相平衡好。这样di一针时总是与后面的不一样。这可能是加快方法的缺点，但是如果转移到有不一样滞后体积的系统时，可能就会产生一些问题。

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