蛋白表达的主力军-CHO细胞

CHO 细胞简介：

CHO 细胞是中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese Hamster Ovary) 的简称，在生命科学研究中具有重要作用。CHO 细胞于 50 年代首次应用于生物医学研究，目前是生物治疗药物 (单抗、酶、激酶和激素等) 中最常用的非人类哺乳动物细胞系。

2014 年至 2018 年，大多数 (约 84%) 批准的单抗药来源于 CHO 细胞 (Walsh，2018)。CHO 细胞来源的单抗可应用于各种适应症，包括肿瘤、多发性硬化症、哮喘、HIV 和神经母细胞瘤等。

图 1：2014 年生物药排名

迄今为止，已经开发出多种 CHO 细胞系，1. 1956 得到的 CHO-K1(即野生型 CHO 细胞)；2. 敲除 CHO-K1 单 DHFR(二氢叶酸还原酶) 等位基因得到的 CHO-DXB11；3. 通过电力辐射 CHO 细胞群得到两个 DHFR 等位基因都被敲除的 CHO-DG44。虽然 CHO 细胞还有其他衍生细胞系，但是目前进行 CHO 细胞系改造，多以这三种为初始细胞。CHO 细胞系经过基因改造，可提高生产力，减少细胞凋亡并改善糖基化（Zhu 等人 2017）。 金斯瑞也开发了一系列高表达细胞系用于抗体表达。

图 2：CHO 细胞谱系示意图

CHO 细胞特点：

1. 更适用于悬浮培养，可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；

2. 生产的抗体分子结构、功能方面和天然抗体分子较接近；

3. 所含病毒极少，外源基因可以在 CHO 细胞中稳定地整合，并进行高效扩增和表达；

4.CHO 细胞是成纤维细胞，几乎不分泌内源性蛋白，因此对目标重组抗体的分离纯化工作非常有利。但是用于生物治疗药物的细胞系的选择受到多种因素的影响，例如生产蛋白质类型和重组蛋白质的糖基化图谱。

据报道，CHO 与 HEK293 细胞产生的蛋白质在糖基化和糖结构上存在显著差异 (Croset 等，2012；Goh,Ng 等，2018)。因此，在生物治疗性蛋白质开发阶段中始终使用特定的细胞表达系统至关重要。并且，治疗性单克隆抗体开发中，使用 CHO 瞬时表达，是初期体外实验的较佳选择。利用重组单克隆抗体的高产量 CHO 稳定表达是通往后期临床前阶段的一条推荐途径。这种方法增加了候选物保留经药理和毒理学表征的既定糖基化模式的可能性（Jain 等人 2017，Sifiniotis 等人 2019）。

图 3：Ab 药物开发概念阶段的示意图

表达系统开发：

CHO 细胞系开发的目标是改造 CHO 细胞以表达大量重组蛋白，并在细胞倍增时稳定地保持这种生产水平。基本的策略如下：

1. 表达载体构建-质粒：

质粒包括重组蛋白和靶细胞必需的遗传元件。目的基因的序列在密码子、tRNA 使用、GC 含量、核糖体结合序列和去除不必要的二级结构等方面进行优化，从而提高重组蛋白的表达。金斯瑞基于「人群免疫算法」的算法开发了免费的 GenSmart™ Codon Optimization 密码子优化工具，旨在通过对野生型或重组基因序列的优化，来提高在原核或哺乳动物表达系统中蛋白表达量。质粒中的启动子来源于病毒、小鼠或人类中，可引导重组蛋白表达。鼠或人源的巨细胞病毒启动子 (CMV) 是常用的启动子，弱启动子猿猴病毒 40 (SV40) 和劳斯肉瘤病毒 (RSV) 启动子也是较常使用的启动子。其他经常使用的启动子包括 CHO-EF1 α(CHEF1)、CR5 等。通常来说，强启动子用于基因表达，弱启动子用于表达选择基因。

为了筛选表达目的蛋白的细胞，质粒中包含筛选基因，例如产生氨基糖苷 30 -磷酸转移酶 (APH 30 II) 的 neo 基因用于 G418 抗性，hph 磷酸转移酶基因用于潮霉素抗性，Shble 基因用于抗性 zeocin，或 pac 基因编码的嘌呤霉素 N-乙酰转移酶用于嘌呤霉素抗性。

2. 递送系统选择：

转染是指由生物、化学或物理等方法将外部核酸转移到细胞的过程。为获得最佳的表达效果，必须具有有高转染效率、低细胞毒性且对细胞正常的生理过程有最低的影响。生物方法采用病毒载体作为递送方式。逆转录病毒将 DNA 转导入细胞有很长的历史，但是直到近期才应用于工业生产。化学方法涉及各种阳离子试剂，如磷酸钙、脂质和聚合物等。CaPO4 沉淀是最早的方法，但已被更方便的基于脂质的试剂（Lipofectamine）所替代。聚乙烯亚胺 (PEI) 是一种低成本的化学替代方法。 显微注射、磁性纳米粒子磁化和电穿孔是物理的方法。 由于方便且没有知识产权保护，电穿孔成为工业制造生物治疗细胞系的首选方法。 转染根据细胞系和 DNA 递送方法的不同，效率可以从 5% 到 100% 不等。 CHO 细胞使用 CaPO4 可达到 5–40%，脂质可达到 20–60%，逆转录病毒转导可达到约 100%。

3. 鉴定高表达克隆细胞：

鉴定高表达的细胞是细胞系开发中的重要一步。有效的筛选方法可以加速获得目标细胞系。传统筛选方法是有限稀释法，将细胞通过有限稀释到较低的细胞密度，然后将细胞转移到 96 空板，接着利用 ELISA 鉴别表达量最高的克隆。同时，用于自动化识别单克隆的仪器比如：ClonePix™、Pickolo™，他们能够在半固体培养基中挑选高表达集落，并通过 LEAP™富集高表达细胞。虽然细胞系的单克隆性引起了监管部门的注意，但是目前没有可用的监管指南。证明细胞系单克隆的最佳方法是在初步筛选的过程中对细胞及进行成像，以证明所选择细胞系来自于同一个细胞。

4. 稳定高表达细胞系扩大培养-细胞库：

一旦确定了主要候选细胞系，需要制备每个细胞系的研究细胞库 (RCB，Research Cell Bank)，然后从 RCB 制备开发细胞库 (DCB，Development Cell Bank)。DCB 用于生物制品开发以及早期研究材料的生成。对于小型研究项目，可能只需要少量冻存细胞。然而，为了继续提供用于生产治疗性蛋白质的细胞系，通常最好准备两种细胞库：主细胞库 (MCB，Main Cell Bank) 和工作细胞库 (WCB，Working Cell Bank)。MCB 由表达适合水平的稳定单个细胞系构成，WCB 来自于 MCB。每个 MCB 和 WCB 通常包括 100–300 冻存样品。若 WCB 在生产过程中用完，可用 MCB 生成新的 WCB。 MCB 和 WCB 应在使用前进行充分表征无菌性、无支原体和外来病毒污染。

5. 细胞稳定性确认：

细胞系的特性在长时间连续传代期间可能会发生变化，例如，细胞系可能会失去表达能力。因此，对细胞进行表征以确保大规模生产的一致性并确保维持源自细胞的蛋白质的特性至关重要。

对于生产细胞系，必须建立所需特征的可接受稳定性水平，并且必须定义最大传代数以便在低传代和广泛传代后可以对细胞特征进行比较。必须进行肽图谱、氨基酸测序、DNA 指纹图谱、基因拷贝数和表型标记测定等测试，以确保细胞的遗传稳定性。此外，必须检查细胞表达蛋白量和产品质量以评估细胞系的稳定性。

一个好的生产细胞系应该能够在达到大规模生产结束所需的多代中保持其生产力和产品质量。在大多数情况下，保持 50 代的稳定性将满足大规模制造的严格要求 。

图 4：CHO 细胞瞬转和稳转示意图

最后，尽管在生物制品中使用非人类哺乳动物细胞有一些弊端，但对于 CHO 细胞，经过数十年已经在其安全性方面积累了足够的证据，CHO 细胞能成功地生产具有活性且患者良好耐受的抗体（Jayapal 等，2007）。 因此，预计 CHO 细胞在生物制品中的主导地位将继续下去，并有一条通向监管部门批准的明确途径作为后盾。

参考文献：

1.Chin, C. L. et al. A human expression system based on HEK293 for the stable production of recombinant erythropoietin. Sci. Rep. (2019)

2.Croset, A. et al. Differences in the glycosylation of recombinant proteins expressed in HEK and CHO cells. J. Biotechnol. (2012)

3.Dumont, J., Euwart, D., Mei, B., Estes, S. & Kshirsagar, R. Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives. Critical Reviews in Biotechnology (2016)

4.Goh, J. B. & Ng, S. K. Impact of host cell line choice on glycan profile. Critical Reviews in Biotechnology (2018)

5.Jain, N. K. et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr. Purif. (2017)

6.Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W. S. & Yap, M. G. S. Recombinant protein therapeutics from CHO Cells - 20 years and counting. Chem. Eng. Prog. (2007).

7.Sifniotis, V., Cruz, E., Eroglu, B. & Kayser, V. Current Advancements in Addressing Key Challenges of Therapeutic Antibody Design, Manufacture, and Formulation. Antibodies (2019)

8.Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nat. Biotechnol. (2018)

9.Zhu, M. M., Mollet, M., Hubert, R. S., Kyung, Y. S. & Zhang, G. G. Industrial Production of Therapeutic Proteins: Cell Lines, Cell Culture, and Purification. in Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology (2017).

图片来源：文献和金斯瑞

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