在线电化学方法实现免疫球蛋白链间/链内二硫键的还原

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins1。该文章的通讯作者是来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学院的Martijn M. Vanduijn研究员。

许多蛋白质中都包含着二硫键，二硫键是指连接不同肽链或同一肽链中两个不同半胱氨酸残基的巯基组成的化学键（-S-S-）。在蛋白质分子中，二硫键起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界影响的能力就越大。维持二硫键的完整有利于蛋白质的液相色谱分离，但却给后端的质谱分析带来了挑战。常规的方法是在质谱分析前期对蛋白质进行变性、还原、烷基化处理，这些前处理过程可以有效的减少二硫键对后续酶切或二级碎裂（MS/MS）的干扰，但却非常繁琐耗时，除了会产生副反应以外，蛋白样品也可能在前处理过程中发生丢失。一个有效的替代方法是采用电化学还原。一个配备金属电极的流通池，仅需要施加适当电压于电极上，流通池中蛋白分子上的二硫键就可以被还原。目前，这种微型电化学反应池已实现商业化，可在线连接至质谱前端，蛋白样品经电化学还原，离子源活化，二级碎裂后可直接进行基于MS/MS谱图的序列匹配。尽管如此，电化学反应池在设计、电极材料组成、流通池的大小以及施加的电势等方面仍在不断的提高与创新。

免疫球蛋白（抗体）包含有多个链间/链内二硫键。Simone Nicolardi等人曾在2014年将电化学反应器与FTICR质谱联用用于单克隆抗体的分析，从MS1谱图中可以明显地观察到单克隆抗体由于链间二硫键还原后生成的重链和轻链。然而，由于还原不完全，导致重链/轻链上的链内二硫键仅部分打开。类似的不完全还原在Kasper D. Rand组中电化学还原与氢氘交换质谱联用中也能观察到。这种不完全还原会影响蛋白中肽链的精准测量（一对二硫键引起2 Da的质量偏差），同时，关闭的二硫键也会干扰其跨度区域的二级碎裂，碎裂产物也较难通过计算软件进行预测或分析。本文介绍了一种改进的在线电化学还原方法可以实现单克隆抗体链间/链内的完全还原。装置如图1所示，蛋白样品注入系统后在1μL/min的流速下进行色谱分离，色谱柱后流出液与19 μL/min的补充液（1%甲酸，50%乙腈）在T型管中混合，随后以20 μL/min的流速经过电化学反应池（电化学反应池固有体积为19 μL），最终还原后的反应液进入质谱进行检测。值得注意的是，补充液中的50%乙腈有利于蛋白变性，而1%甲酸则为还原反应提供氢原子，促进还原反应的进行。

图1. 在线电化学反应池耦联质谱装置示意图

为了考察整个方法的可行性及普遍适用性，作者利用该装置对一系列的单克隆抗体进行了电化学还原和质谱检测。如图2A为贝伐珠单抗在800 mV还原电势下色谱分离的总离子流图（TIC），图2B为图2A中色谱峰所对应的一级质谱图（MS1）。从MS1可以看出有两组电荷态分布分别对应重链和轻链，说明在800 mV电势下，贝伐珠单抗链间二硫键发生了还原，由于还原发生在色谱分离之后，所以重链和轻链产生了共流出，仅在TIC图中观察到一个色谱峰。相比较柱前还原，这种色谱柱后二硫键还原会导致肽链的共流出，质荷比接近的肽链则会产生重叠的电荷分布进而干扰谱图的解析。但这种方法在分析复杂的蛋白样本具有明显有优势，可以将还原后生成的肽链与蛋白母体相关联，方便溯源。图2C则为贝伐珠单抗在不同电势下的还原情况，随着电势的逐渐增加，MS1去卷积谱图上逐渐观察到部分还原生成的重链、轻链或重轻链组合，当电势达到1000 mV时，几乎所有的链间二硫键都实现了还原。对于链内的二硫键，由于还原产生的质量改变较小（轻链包含两个二硫键，还原后质量增加4.032 Da），且存在未还原、部分还原以及完全还原肽链间的信号干扰，所以不太容易从MS1谱图确认链内二硫键的还原情况。但轻重链朝高电荷态偏移（图2D）间接说明链内二硫键在打开，肽链更加舒展，更容易质子化。

图2. 在线还原系统分析贝伐珠单抗：A）贝伐珠单抗总离子流图；B）对应色谱峰的一级质谱图；C）在不同还原电势下的一级质谱图（去卷积）；D）重链在不同还原电势下电荷态的偏移。

为了更加准确地评估链内二硫键的还原情况，作者模拟了不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布情况。如图3A，从上到下分别是模拟的完全还原（4 x SH）、部分还原（SS + 2 x SH）以及未还原（2 x SS）同位素分布。将实验测得同位素分布与模拟的同位素分布进行比对，计算每种氧化还原形式对总信号的贡献占比（图3B）。经过比对发现在1000 mV的电化学还原下是可以实现链内二硫键的完全还原的。因此，最终电化学还原设置为1000 mV。链内二硫键的完全还原可以极大的提高肽链的碎裂效率，获得更加丰富的MS/MS数据用于序列匹配。如图4所示，贝伐珠单抗以及西妥昔单抗的轻链19+电荷态被分离并碎裂。可以看到当施加1000 mV还原电势在质谱分析的前端时，轻链的二级碎片明显增加，特别是横跨链内二硫键的区域（图4，黄色阴影）。此外，在质量匹配的过程中也可以观察到二硫键处于还原状态，考虑还原氢引起的质量增加可以实现更多二级碎片的匹配。

图3. A）不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布模拟；B）不同实验条件下的二硫键还原情况

图4. MS/MS数据评估链内二硫键的还原情况

总之，本文开发了一种在线电化学还原方法能够实现免疫球蛋白链间/链内二硫键的完全还原。该方法能够简化蛋白样品的前处理过程，方便后续的质谱测定。与之前的电化学反应器相比，该系统能实现链内二硫键还原的主要原因可能有以下几点：1、电化学流通池所用的表面材料，之前是全钛的设计，现在是表面镀铂。2、之前是三电极配置（工作电极，参比电极，辅助电极），而现在的设计减少至两个电极，驱动还原的电势适用于这种调整后电极配置。3、补充液的条件（50%乙腈和1%甲酸）对还原有利。此外，该电化学系统仍有需要改进的地方，例如：电化学反应池的体积过大、还原电势过高会影响质谱检测的信噪比等。该方法具有广阔的应用前景，无论是在蛋白质组学还是在结构质谱分析中。

撰稿：刘蕊洁

编辑：李惠琳

原文：Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins

参考文献

1.Vanduijn MM, Brouwer HJ, Sanz de la Torre P, Chervet JP, Luider TM. Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins. Anal Chem. 2022, 94(7): 3120-3125. 

2.Nicolardi S, Deelder AM, Palmblad M, van der Burgt YE. Structural analysis of an intact monoclonal antibody by online electrochemical reduction of disulfide bonds and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal Chem. 2014, 86(11): 5376-5382.

3.Trabjerg E, Jakobsen RU, Mysling S, Christensen S, Jørgensen TJ, Rand KD. Conformational analysis of large and highly disulfide-stabilized proteins by integrating online electrochemical reduction into an optimized H/D exchange mass spectrometry workflow. Anal Chem. 2015, 87(17): 8880-8888.