Nat.Protoc.南京大学刘震教授团队实现单个活细胞内低拷贝数蛋白质的分析|前沿用户报道- 工业快报

供稿：温艳蓉

成果简介

2021年6月，南京大学刘震教授团队在Nature子刊Nature Protocols上发表了题为 “Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays”的论文，创新性地发展了单细胞等离激元免疫夹心法，成功实现了单个活细胞及活体动物内多种低拷贝数蛋白质的分析。

背景介绍

细胞是生物体结构和生命活动的基本单位，基于细胞的研究是生命科学的基础。其中，基于单细胞分析的生命科学研究能够从更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。

蛋白质是生物学功能的直接执行分子，在单个细胞内分子数目少于1000个拷贝数的蛋白质被称为低拷贝数蛋白质。虽然低拷贝数蛋白质的丰度极低，但它们在多种重要的生物学过程中起着关键的调控作用。纵观整个单细胞分析技术领域，蛋白质的分析手段远远滞后于基因组和转录组的分析方法，其最根本的原因是蛋白质的研究缺少类似于PCR的扩增工具，导致很多低丰度的蛋白质十分难以检测。因此，发展适用于单细胞内低拷贝数蛋白质的检测技术具有重要的科学意义和应用价值。

刘震教授团队将免疫识别与等离激元拉曼检测技术相结合，创新性地发展了一种等离激元免疫夹心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA），成功实现了单个活细胞及活体动物内多种低拷贝数蛋白质的分析（Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55, 13215）。此后，该方法还扩展到单个活细胞中的microRNA的分析（Chemical Science, 2018, 9, 7241）以及基于生理样品中的蛋白质和microRNA标志物的疾病诊断分析（Analytical Chemistry, 2016, 88, 12363；Analytical Chemistry, 2019, 2019, 91, 4831；Analytical Chemistry, 2019, 91, 9993；Biosensors and Bioelectronics, 2019, 145, 111729）。同时，该技术还被成功应用于单细胞信号通路研究和抗癌药物活性评价（Analytical Chemistry, 2020, 92, 12498）等应用。

图文导读

单细胞等离激元免疫夹心法（scPISA）的工作流程示意图如图1所示。包括三个主要步骤：细胞内萃取、标记和检测。

1.将固定有亲和配基的金基微萃取探针在显微操作系统的控制下，准确地插入单个活细胞内特定部位进行目标蛋白的富集。

2.萃取一定的时间后将微萃取探针从细胞内拔出，经过适当的清洗步骤降低微萃取探针表面的非特异性吸附，再用亲和配基功能化的银基纳米拉曼标签对富集到的目标蛋白质进行标记，从而在微萃取探针表面形成类似三明治夹心结构的微萃取探针-目标蛋白质-纳米拉曼标签免疫复合物。

图1. 单细胞等离激元免疫夹心法的工作示意图

3.将共聚焦拉曼光谱仪和细胞显微操作平台耦合（图2 c），使用拉曼光谱仪的DuoScan功能对悬挂在细胞显微操作臂上的微探针进行分析（图2 d），从拉曼的强度信息中得出细胞内低拷贝数蛋白的丰度，细胞内分布等信息（图2 f）。HORIBA共聚焦拉曼光谱仪的DuoScan功能可以对微萃取探针的各个区域进行原位分析，所得到的信号强度变化反应细胞内蛋白的相应变化，能够实现“所见即所得”。当激光照射在该免疫复合物的表面，金基微萃取探针和银基纳米拉曼标签之间纳米级间隙内由于等离激元耦合作用产生“热点”，显著地增强纳米标签的表面增强拉曼散射（SERS）信号，灵敏度达单分子水平，从而能够实现低拷贝数生物分子的检测。

图2. 拉曼光谱采集与分析

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文献信息

Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays

文章署名作者：

Jia Liu, Hui He, Dan Xie, Yanrong Wen, Zhen Liu

文章链接：

https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9

刘震教授简介

南京大学特聘教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者。英国皇家化学会会士、中国化学会高级会员、美国化学会会员，兼任国际分子印迹学会理事会理事、中国质谱学会常务理事、中国化学会质谱专业委员会委员、中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会委员、《Analytica Methods》副主编、《Electrophoresis》、《Separation Science Plus》等杂志编委。主要从事分子识别、亲和分离、疾病诊断、单细胞分析和癌症纳米治疗等研究，主持国家重大科研仪器项目和基金委重点项目等国家级科研项目10余项，已在Chemical Society Review，Accounts of Chemical Research，Angewandte Chemie International Edition，Nature Protocols，Chemical Science等期刊上发表论文150余篇，目前h因子49（谷歌学术），主编及合著著作2部，出版专章7章，获授权专利15项。

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