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01
什么是双荧光素酶报告系统？
双荧光素酶报告系统通常是指萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，F-Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase，R-Luc）组合而成的双报告系统。其中，F-Luc是从萤火虫Photinus pyralis中分离出来的；R-Luc则是从海肾Renilla reniformis中分离出来的。
这两种酶都能催化底物发光，但它们在进化上的起源不同。因此，他们具有不同的酶学结构和底物要求：F-Luc需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；R-Luc仅需要腔肠素和氧气。此外，他们发光的颜色不同：F-Luc的光波长为550-580nm；R-Luc的光波长为470-490nm。
正是由于这两种酶的底物和发光波长不同，互不干扰，所以在双报告系统中得到广泛应用。
发光反应方程式
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单荧光素酶实验的结果往往会受到各种实验条件（比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）的影响，而双荧光素酶实验中，通常以海肾荧光素酶为内参，对萤火虫荧光素酶的检测结果做均一化处理，使得最终的数据更为准确。
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一、miRNA与靶标基因相互作用
1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中的3’UTR区域，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性。
二、启动子分析
1. 启动子结构分析。将启动子区域序列进行分段截短或对特定位点进行突变，再分别连接到报告载体，荧光素酶活性变化可以指示启动子功能变化。
2. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。
3. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
三、信号通路分析
将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。
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常用的双荧光素酶载体是什么？
载体的选择有两种策略：
第一种方案是两种荧光素酶分别位于两个载体上，。
海肾荧光素酶常用载体为pRL-TK。萤火虫荧光素酶载体会根据实验需求进行不同的选择，比如启动子荧光分析相关研究可以选用Pgl3-Basic载体，miRNA与靶标基因相互作用的相关研究可以选用pMIR-REPORT载体。
pRL-TK
Pgl3-Basic
pMIR-REPORT
第二种方案就是将萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，这样偏差更小，在这方面，现在比较有名的是pmirGLO载体。
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