靶向捕获测序助力病毒追击

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新冠疫情肆虐全球，各种检测分析技术「八仙过海」助力抗「疫」。其中高通量测序技术在新冠病毒（2019-nCoV、SARS-CoV-2）的发现与鉴定中立下了汗马功劳。近些年来，高通量测序技术在病毒的检测、鉴定与分析中的应用，极大地推动了病毒研究的发展，在公共卫生事业中展现出了巨大的价值。本文我们将重点介绍，高通量测序这位「新警察」在追击病毒中的「三十六计」。

病毒基因组测序的方法主要有两类：宏基因组测序（metagenomics next generation sequencing, mNGS）和靶向测序（targeted sequencing，tNGS）（图 1）¹。mNGS 对样本中的多物种基因组实行「一网打尽」的策略；后者主要针对靶标病毒实行「有的放矢」的策略。

图 1. 对临床样本进行病毒基因组测序的方法。样本最初包含宿主（蓝色）和病毒（红色）DNA 序列。对于 RNA 病毒基因组，样本中的 RNA 应被转化为 cDNA 后再进行扩增和文库构建。宏基因组可以更准确地反映样本中原本的序列组成，但测序和数据分析成本高昂；PCR 扩增子测序借助多重 PCR 反应来富集病毒基因组；液相杂交靶向捕获测序利用根据病毒序列设计的探针，通过杂交富集病毒序列。

宏基因组测序

mNGS 目前已被广泛用于病原体检测及环境 / 临床样本中的微生物多样性的分析。 其优势在于无需病毒基因组的先验知识，有利于发现新的病毒；其缺点在于易受宿主及其他微生物核酸影响，检测灵敏度降低。新冠疫情发生初期，肺炎病人经免疫法、PCR 法检测，流感、衣原体、支原体及腺病毒等病原均为阴性，最终便是靠 mNGS 缉拿真凶 —2019-nCoV²。

mNGS 是未知病原体鉴定的利器，但是当样本中致病病毒含量过低或其他原因造成 NGS 文库中致病病毒序列占比过低时，只能通过增大测序量来获得更多的序列。而通过样本的各种前处理来提高特定病毒的含量，是一个非常繁琐且需要反复优化的过程。在对已知的病原体进行追踪分析，或鉴定同类病毒的新亚型时，靶向测序会则更为有效。

靶向测序

tNGS 主要分为两种：基于引物 PCR 扩增的扩增子测序和基于探针杂交的杂交捕获测序。

多重 PCR 常用于富集基因组较小（不超过 20 kb~50 kb 级别）的病毒基因组，仅需少量 PCR 扩增即可实现整个基因组的组装。其缺点在于富集区域由引物位置限定，当基因组较大或病毒的多态性较高时，设计难度大。同时，若某一对引物没有正常工作，可能出现明显的覆盖缺失。

相较多重 PCR，杂交捕获的探针长度通常为 120 nt，在对靶标的特异性和容错性上具有更好的平衡。探针与随机断裂的片段杂交，捕获到的序列不限于探针本身对应的区域，相邻探针有互相补充的作用，因此对病毒的多态性具有更高的宽容度。不仅可以显著地富集病毒序列提升病毒基因组覆盖，而且可以在一定范围内发现新的病毒。

整体来讲，与 mNGS 相比，tNGS 能够提升已知病毒的检测灵敏度，但同时增加了引物或探针合成的初始成本与实验步骤。扩增子测序适合于病毒基因组较小或只针对特定区段，序列明确，预期多态性较低的应用场景。而杂交捕获技术适用的病毒基因组范围更广，在大型病毒及高遗传多样性病毒的分析中优势明显。

掺入引物富集技术

mNGS 与 tNGS 各有所长，但是有没有一种方法，可以富集特定的病毒，又保留 mNGS 的广谱性？发表于 Nature Microbiology 上的一篇研究为我们提供了新思路：mNGS 辅以掺入引物富集技术（metagenomic sequencing with spiked primer enrichment，MSSPE）。这项技术通过在逆转录反应中掺入针对特定病毒设计的 13 nt 引物，与随机引物一起工作，在进行 tNGS 前，对靶标病毒进行预富集，以更可控的成本，兼顾了 mNGS 和 tNGS³。

MSSPE 技术对病毒的富集提升了 mNGS 对目标病毒的检测能力，且改善了对病毒基因组的覆盖率。针对 15 种病毒，研究人员设计了 MSSPE panel，对 mNGS、MSSPE、多重 PCR、杂交捕获以及 MSSPE 联合杂交捕获这 5 种方法进行比较（图 2）。例如对低滴度（666 ~ 3,340 拷贝 /mL）的 ZIKV 病毒样本，经 MSSPE 技术预富集后的杂交捕获，可将 ZIKV 的 reads 数进一步提升 6 倍，基因组覆盖率增加 25 ~ 80%（58.5±21.5%）³。

图 2. 不同富集方案对 ZIKV（～ 2,000 拷贝 /mL）的覆盖率。图自上而下依次为：mNGS 产生的覆盖结果（33 reads，26.5% 覆盖率）；MSSPE（使用 ZIKV spiked 引物）产生的覆盖结果（260 reads，87.5% 覆盖率）；多重 PCR 产生的覆盖结果（158,243 reads，88.2% 覆盖率，75.0% ≥ 10 x coverage）；捕获探针产生的覆盖结果（49,927 reads，49.1% 覆盖率，29.6% ≥ 10 x coverage）；MSSPE + 捕获探针产生的覆盖结果（275,105 reads，99.8% 覆盖率，95.6% ≥ 10 x coverage）。红色条形区域显示了 ≥ 10 x coverage 的区域。

MSSPE 可以很便捷地整合到现有的病毒测序流程中，无论是单独应用还是与靶向测序联合「前后夹击」，都具有极佳的应用前景。

杂交捕获探针设计建议

上述病毒追击策略中，杂交捕获以其在富集能力与对靶标的容错性的平衡，在病毒测序中应用较广。如何降低探针成本，是设计实验中的重要考量因素。

从靶标病毒的确定，到探针设计参考序列的选择，到探针的设计和挑选，病毒的探针设计是一个权衡的过程。若只需要检测到特定的病毒，可以仅根据病毒保守区域或参考基因组为参考设计较少数量的探针；若希望得到更完全的基因组覆盖且尽可能的发现更多的病毒亚型，则需要选择更多的参考序列，所需探针数目会迅速增长。根据探针容错性我们可以合并相似的探针，也可以适量降低探针密度，充分利用杂交捕获技术的优势。但是在这个过程中需要非常谨慎的权衡成本和效能之间的取舍。我们建议在探针设计过程中辅以成熟的、可调整参数的探针设计工具。相关的一些探讨，欢迎您点击下面连接，在线收看我们的《病毒靶向捕获测序之 Panel 设计》主题讲座。

链接：https://e.dxy.cn/broadcast/live/id/12954


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图片来源：纳昂达

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