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大脑深部区域与基本生命功能密切相关，在各种神经疾病中均观察到深部大脑的结构和功能异常，例如帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症和强迫症等。但在啮齿类动物研究模型中，由于神经组织，特别是胼胝体，具有对光的高散射光学特性。如何突破成像深度极限，在自由活动动物上对距离脑表层深度＞1 mm 的结构进行成像存在在极大的挑战。三光子成像技术的出现将成像深度大大扩展至 1500 μm，为非侵入式深脑成像带来了曙光。
助力北京大学发文 Nature Methods
图 1. Nature Methods 文章截图
解析脑连接图谱和功能动态图谱是我国和世界多国脑计划的一个重点研究方向，为此需要打造自由运动动物佩戴式显微成像类研究工具。
※ 2017 年，北京大学程和平院士团队成功研制第一代 2.2 g 微型化双光子显微镜，获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。
※ 2021 年，该团队的第二代微型化双光子显微镜将成像视野扩大了 7.8 倍，同时具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力。
※ 2023 年 2 月，北京大学程和平-王爱民团队再一次实现技术突破，将微型化探头与三光子成像技术结合，并在 Nature Methods 发表文章 「Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 」。文章报道了仅 2.17 g 的微型化三光子显微镜，首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。
图 2. 小鼠佩戴微型化三光子显微镜探头
SUPERNOVA- 3000应运而生
依托专业的研发团队和深厚的技术积淀，SUPERNOVA- 3000 应运而生。SUPERNOVA- 3000 通过高度集成化、系统化、工业化设计将微型化探头的重量控制在 2.2 g。搭配独有的光学设计突破微型化显微镜的成像深度极限，在全球范围内开创性构建自由行为动物深脑成像「新视界」。
深脑「勘探器」，科研「新视界」
Go deeper
利用五阶非线性效应以及穿透力更强的激发荧光（1300 nm），一举突破此前微型化多光子显微镜的成像深度极限。
图 3. 荧光激发示意图
图 4. 小鼠脑组织中散射长度的光谱分布
显微镜激发光路可以穿透整个小鼠大脑皮层和胼胝体，实现对小鼠海马 CA1 亚区形态及功能的直接观测记录。神经元钙信号最大成像深度可达 1.2 mm，血管成像深度可达 1.4 mm。
图 5. 微型三光子显微镜记录小鼠大脑皮层 L1 -L6 和海马 CA1 的结构和功能动态。CC：胼胝体。绿色代表 GCaMP6s 标记的神经元荧光钙信号，洋红色代表硬脑膜、微血管和脑白质界面的三次谐波信号。
More Freedom
• 2.2 g 新型微型化探头
微型化探头通过新型内嵌阿贝聚光镜复合式光学构型，体积仅 2 × 1.6 × 0.9 cm3，实现飞秒激光脉冲无畸变传输、高质量激光汇聚、高效率荧光收集和激发。开创性的将三光子光学组件高度集成在一个微型化探头内。同时外壳使用超轻金属，重量仅 2.2 g 既轻盈又坚固，搭配电动变焦模块、定制光纤、光屏蔽 GaAsP PMT，保证了对自由运动小鼠深脑神经活动的高稳定性、高分辨成像。
图 6. 三光子微型化探头
•激光传导光纤--空芯光子带隙光纤
图 7. 空芯光子带隙光纤截面和输出光斑示意图
图 8. 出口处激光脉冲时间剖面
系列光纤均具有准单模传输、低损耗、低非线性、低色散、高激光器损伤阈值的特点。高效率传输 1300 nm 飞秒脉冲激光，将空间光路转变为光纤传输，强抗弯折性能，使自由运动下观察成为可能。
Less damage
• 非侵入式手术
深脑成像避免使用 Grin Lens，成本更低
手术便捷，成功率更高
对小鼠大脑损伤更小，避免影响小鼠正常神经生理状态
• 超低光毒性
散射荧光增强收集系统——深脑超低功率成像
SUPERNOVA- 3000 创新的使用微型阿贝聚光镜与无限远物镜密接可以提高散射光的通透效率；李斯特微型管镜复用简化结构，优化光路设计，提高荧光收集效率的同时，保证了大视场分辨率。总体上，新微型化显微镜的散射荧光收集效率实现了成倍的提升，实现了在超低成像功率下对自由运动小鼠大脑深部脑区神经元活动进行实时监测。
图 9. 散射荧光增强收集构型
基于散射荧光增强收集构型，实现全皮层钙信号成像仅需十几毫瓦，海马钙信号成像仅需要几十毫瓦，大大低于组织损伤的安全阈值。因此，SUPERNOVA- 3000 可以长时间、不间断连续观测神经元功能活动，且不产生明显的光漂白与光损伤。
图 10. 不同深度脑区超低功率钙成像
生物应用
行为学实验下的小鼠顶叶后皮质 L6（PPC L6）的神经元钙活动（成像深度 650 μm）
微型化三光子显微镜可以搭配不同行为学实验的深部脑区进行单细胞级的稳定高时空分辨率成像，满足实时监测单个神经元的活动，结构变化以及不同功能神经元分类等实验需求。
图 11. 行为学实验下小鼠大脑 PPC L6 的神经元活动
自由运动小鼠大脑海马 CA1 亚区的神经元钙活动（深成像度 1.2 mm）
安全激光功率下通过非侵入式手术对背侧海马 CA1（深度达 1.2 mm）的钙活动进行成像，监测神经元的钙活动轨迹，并与小鼠行为视频进行同步。
图 12. 自由运动小鼠大脑 PPC L6 的神经元活动
长时程监测自由运动小鼠大脑海马 CA1 亚区的神经元钙活动（深成像度 978 nm）
100 分钟不间断连续监测采集自由运动小鼠大脑海马 CA1 亚区神经元活动，钙信号瞬态特征无明显变化（平均振幅，衰减时间常数，SNR）。
图 13. 100 分钟不间断采集自由运动小鼠大脑海马 CA1 亚区神经元活动
大脑组织 3D 重构
国际影响--Nature Methods 发表社评
图 14. 文章部分截图摘自 Benjamin F. Grewe et al. Nat. Methods
3 月，Nature Methods 期刊邀请 Benjamin F. Grewe 等领域专家发表在线社评文章 Deep brain imaging on the move ，特别指出微型化三光子显微镜对于深脑成像的重要意义。三光子成像则将可到达的成像深度大大扩展至 1,500 μm。因此，在小鼠中，微型化三光子显微镜将直接实现对整个大脑皮层及下方区域，例如海马 CA1 进行成像，同时保留完整的大脑皮层结构投影。随着微型化三光子显微镜 SUPERNOVA- 3000 的出现，神经科学的研究人员将可实现对例如涉及纹状体结构的，大脑皮层及皮层下方脑区之间的神经网络进行深入研究
图 15. 微型化三光子显微镜 SUPERNOVA- 3000 示意图
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