上篇丨DeepTech发布《2023年生物医药技术趋势展望》研究报告——基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿

生物医药是关系国计民生的重要产业，是当今世界创新最为活跃、发展最为迅猛的战略性新兴产业之一。新冠肺炎疫情全球大爆发更是凸显了生物医药的重要性，世界各国纷纷把生物医药技术及产业化提升作为国家战略。

随着生物技术的创新发展，许多创新性的技术经过多年的积累和研究的深入，逐步取得重大突破，促进了创新型药物的产业化，推动生物医药行业从具有发展潜力的高技术产业逐步转变为蓬勃发展的高技术支柱产业。

2023年，哪些生物医药技术在未来1-3年具备产业影响力、生物医药产业应用创新有哪些新趋势？

DeepTech密切关注行业发展最新动向，通过文献统计、数据分析、专家访谈等手段，洞悉生物医药技术发展趋势，探寻具备技术颠覆性、具有产业化前景的先进生物医药技术，并客观真实地阐述其发展现状，展望2023年十大生物医药技术趋势。

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DeepTech正式发布《2023生物医药技术趋势展望》研究报告。十项生物医药技术展望，涵盖了生命科学和生物医药的底层技术CRISPR-Cas基因编辑技术、酶促DNA合成、药物递送系统，从基础研究进入临床阶段的异种器官移植、CAR-NK细胞治疗、噬菌体疗法，实现赛道破冰的微生态疗法，以及实现产业化并将有更多创新突破的mRNA药物、抗体偶联药物、双特异性抗体。

2023年，生物医药技术新趋势将重塑产业发展格局，它们可能会对未来生物医药产业的研究方向产生重大影响。未来，生物医药底层技术的革新将推动创新药物从基础研究走向临床试验，并最终实现产业化，推动创新药物研究和生物医药产业发展进入革命性变化的时代，最终为人类的生命健康保驾护航。

基础技术篇——基础技术的突破不断引领

生物医药创新前沿

基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿。新型基础技术的出现和改进会引领相关领域爆炸式发展，加速临床应用和产业化进程，从而解决更多尚未满足的临床需求。

CRISPR-Cas系统的发现引领了基因编辑领域突破性发展，技术改进将追求精准化、灵活化、迷你化，促进基因编辑疗法的临床应用。酶促DNA合成将引领新一轮的DNA合成技术革命，实现长片段DNA高效率、高精度、低成本合成，极大地拓展DNA的应用范围，推动合成生物学的巨大进步。

药物递送系统是创新药物研发不可避免的话题，新型药物递送系统在不断涌现，大幅缩短创新药物研发周期，撑起创新药物研发的半边天。

CRISPR-Cas系统是继ZFN、TALEN之后的第三代基因编辑技术。它的出现推动了基因编辑技术的发展，已经成为当今世界应用最广泛的基因编辑技术，成为生命科学最主要的底层技术之一。

CRISPR-Cas系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，其中Cas9蛋白起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用。在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。

根据CRISPR-Cas作用模块的数量和种类，CRISPR-Cas系统分为两大类。第一类CRISPR-Cas系统由多个Cas蛋白亚基组成的多蛋白效应复合物和crRNA组成，又可细分为I型、III型和IV型；第二类CRISPR-Cas系统为单一蛋白效应器，又可细分为II型、V型和VI型。目前，已经鉴定的CRISPR-Cas系统中，以第一类CRISPR-Cas系统为主，占比多达90%左右，广泛分布于细菌和古生菌中。由于第一类效应复合物由多蛋白组成，基因编辑过程复杂，实用性不佳。

而第二类CRISPR-Cas系统由Cas蛋白发挥DNA或RNA的切割功能，切割靶序列效率高，且单个蛋白易于改造，因而第二类CRISPR-Cas系统被最早开发并广泛应用于基因编辑中。其中，最常用的是Cas9、Cas12a和Cas13a。

▲图丨Cas9、Cas12和Cas13基因编辑原理图（来源：Molecular Cell）

Cas9是最早被发现和表征的二类II型效应蛋白，是目前应用最为广泛的Cas蛋白之一。Cas9是由crRNA和反式激活crRNA（tracrRNA）引导的DNA 核酸内切酶。CRISPR序列转录为pre-crRNA，随后加工为成熟的crRNA，并与tracrRNA、Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合体。

当Cas9蛋白识别富含鸟嘌呤PAM序列（如NGG，其中N代表任意核苷酸），并且crRNA与靶DNA序列互补，那么Cas9会在PAM序列上游约3-4 个核苷酸对双链DNA进行切割，引发DNA双链断裂，形成平末端。

Cas12a，最早称为Cpf1，是二类V型效应蛋白，也是目前应用最为广泛的Cas蛋白之一。Cas12a同时具有DNA和RNA 内切酶活性，可以不依赖于tracrRNA而将pre-crRNA加工为成熟的crRNA。Cas12a识别富含胸腺嘧啶的PAM序列（如TTN），并在PAM序列下游对双链DNA进行切割，形成粘性末端。

与Cas9和Cas12a不同，Cas13a是靶向RNA的核酸酶，属于二类VI 型效应蛋白。Cas13a与crRNA、底物结合形成三元复合体后，Cas13a蛋白被激活，对底物单链靶RNA进行切割。

▲图丨常用Cas蛋白特征（来源：Molecular Cell，DeepTech整理）

Cas蛋白的固有缺陷限制了CRISPR-Cas系统的应用。PAM序列限制了靶目标的范围，如Cas9识别的PAM序列为NGG，在人类基因组中平均每八个碱基才有可能出现一个PAM序列，严重制约了其对基因组大部分位点的编辑。脱靶效应也是CRISPR-Cas系统面临的一大问题，gRNA同靶序列的结合可以允许多个碱基的错配，这导致了基因编辑过程中会发生不可预测的脱靶，这对于精准的基因编辑来说是一个不可忽视的问题。

另外，由于常用的Cas9、Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而递送系统AAV病毒的包装上限约为4.7kb，不利于CRISPR-Cas系统的递送。这些问题都极大地影响了基因编辑的精准性、可控性、灵活性和安全性，限制了CRISPR-Cas系统新功能和应用范围的拓展。因此，优化改造Cas蛋白、寻找更小的Cas蛋白、发掘更优的新型系统等成为近年来CRISPR-Cas系统研究的重点方向。

优化改造Cas蛋白，提高基因编辑的精准性和灵活性。脱靶效应和PAM的序列限制是影响CRISPR-Cas系统应用的核心问题，因此需要对Cas蛋白进行优化改造，从而提高靶向特异性，克服脱靶率问题，并突破PAM限制，扩展靶序列的识别范围。目前，已经有众多工作开展，构建了多个Cas蛋白突变体。例如，通过合理设计并定向进化开发高保真的Cas9变体，得到高保真蛋白enAsCas12aHF1。新开发的两种Cas9变体SpG和SpRY，不需要特定的PAM来结合和切割DNA序列。

▲图丨部分工程化改造的Cas蛋白变体（来源：Synthetic Biology Journal，DeepTech整理）

Cas蛋白迷你化提高CRISPR-Cas系统的递送效率。新开发的小型Cas蛋白 Nsp2-SmuCas9嵌合体，长度约为1000氨基酸, 可识别N4C PAM序列，但其编辑活性仍有待提高。迷你蛋白Cas14，又称为Cas12f1，只有400-500个氨基酸。近年，基于该蛋白又开发了多款迷你蛋白，如DpbCas12e（约1000氨基酸）、Cas12j（又称CasΦ， 700氨基酸）、Un1Cas12f1（537氨基酸）、AsCas12f1（422氨基酸）、SpaCas12f1 （497氨基酸）和CasMINI（源自Un1Cas12f1，529氨基酸）。不过这些蛋白还存在编辑活性低的问题，有待进一步改进。

我国辉大基因开发了Cas13X.1（又称Cas13e.1，775氨基酸）和Cas13Y（又称Cas13f，790氨基酸），并于2022年获得美国专利局授予专利，成为我国首个自主研发的、在美国获得专利授权的CRISPR-Cas13基因编辑工具，打破了欧美在基因编辑工具领域的专利垄断。

发掘新型Cas蛋白，扩大CRISPR-Cas系统的应用范围。Cas7-11是通过大数据挖掘找到的一类独特的III-E型CRISPR-Cas系统，与传统的多组分效应蛋白复合物不同，该系统具有单一的效应蛋白Cas7-11（由传统的Cas11和Cas7融合而成），具有crRNA加工和序列特异性RNA切割活性，为哺乳动物细胞提供了一种新的RNA敲除工具，其脱靶效应比当前的RNA敲除技术更低。

2023年首个CRISPR基因编辑疗法有望获批上市。CRISPR-Cas系统的广泛应用推动了相关生物医药技术的发展。美国Vertex制药公司和CRISPR Therapeutics公司目前正在开发基于CRISPR-Cas9系统的exa-cel疗法，使用CRISPR-Cas9技术编辑有缺陷的基因系统治疗β-地中海贫血和镰状细胞病这两种遗传性血液疾病。2022年9月，基于良好的临床试验结果，Vertex公司和CRISPR Therapeutics启动exa-cel疗法的上市申请，有望于2023年获批上市。

酶促DNA合成是指在不依赖于DNA模板的情况下，通过酶促反应实现DNA分子的从头合成。这个技术的核心便是实现酶促反应的末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）。

TdT是一种不依赖于DNA模板的单链DNA合成酶，整个催化过程中不需要经过变性、复性和延伸反应，在恒温和金属离子辅助的条件下，催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）聚合到寡核苷酸的 3' 末端，从而合成寡核糖核苷酸链。TdT具有无模板依赖的快速聚合活性，能够实现长链DNA合成。另外，TdT对底物的选择性较低，dNTP、核糖核苷三磷酸（rNTP）以及修饰的核苷三磷酸类似物均可以作为的TdT底物。

化学合成法在DNA合成长度、成本和环保等方面存有问题。目前，市面中最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法。该化学合成法需要4-5个反应步骤，每个步骤可能会有错误，随着合成链的延长，合成的准确率会大幅下降，合成产物得率也明显下降。这导致化学合成法合成的DNA片段长度最多能达到200-300nt。

若想得到更长的DNA片段，需要将短片段不断拼接组装，拼接组装过程大幅增加了长链DNA合成成本。另外，化学合成法需要大量使用有毒化学试剂，合成产生的废液、废气需要特殊处理。

酶促DNA合成技术推动DNA合成技术再次升级。酶促DNA合成技术只需要2-3个反应步骤，可以提高DNA合成的准确率，缩短DNA合成时间。酶的高特异性支持长片段DNA的合成，或能够合成长达8000nt的DNA序列，酶促合成技术有望将长片段DNA合成的成本降低2-3个数量级。

酶促DNA合成反应在温和条件和水相中进行，整个催化合成过程绿色环保，不产生危险废物废液。与化学合成法相比，酶促DNA合成技术在DNA合成长度、准确率、成本及环保等方面具有巨大的潜力，因而被认为将引领新一轮的DNA合成技术革命。

▲图丨TdT两步循环合成DNA （来源：ACS Cataliysis）

酶促 DNA 合成技术日趋成熟，极具商业化潜力。目前，市场上出现了一批以酶促DNA合成技术为核心的商业化公司，如Molecular Assemblies、Nuclera、DNA Script、Ansa Biotechnologies等。Molecular Assemblies、Nuclera和DNA Script这3家公司均是以TdT酶为核心，通过修饰核苷酸分子制备带有可逆终止基团的核苷酸单体，该修饰的核苷酸单体使TdT酶每次只添加单个碱基，之后去除掉新添加碱基的可逆终止基团后开始下一个碱基的合成，进而实现DNA的合成。

其中，Molecular Assemblies和Nuclea可逆终止基团选择的是3’-O-叠氮甲基，DNA Script选择的是3’-O-氨基。2022年4月，DNA Script推出基于专有酶促 DNA 合成技术的DNA打印机SYNTAX，并推出早期使用计划，允许客户率先使用SYNTAX平台。

Ansa Biotechnologies公司开发了dNTP-TdT偶联体介导的可逆终止合成法。该方法将碱基偶联在TdT上，酶促合成过程中每添加一个dNTP-TdT后，由于TdT共价结合在合成DNA的3’端，阻止了新碱基的继续添加，随后再通过偶联TdT的剪切、洗去、再添加实现碱基逐个添加到DNA的3’端，从而合成DNA。2022年，该公司获得6800万美元融资，用于加速基于dNTP-TdT的酶促DNA合成技术的开发，构建高通量合成仪器。

中国团队实现酶促DNA合成的重大突破，提高DNA合成的效率和准确度。2022年，中国科学院天津工业生物技术研究所江会锋团队通过生物信息学的技术筛选到高效催化活性的鸟类TdT；通过理性设计和高通量筛选策略，对筛选到的鸟类TdT进行改造，重塑ZaTdT催化活性腔，获得新的TdT突变体，即ZaTdT-R335L-K337G，该突变体的催化效率比哺乳动物TdT催化效率高3个数量级，大幅提升了对氧氨基修饰核苷酸（3'-ONH2-dNTPs）的特异性识别和催化合成能力。

利用ZaTdT-R335L-K337G可以通过两步循环步骤实现DNA的合成，平均准确率可以达到98.7%，媲美商业化的DNA化学合成法。下一步该团队瞄准长片段DNA合成，通过优化合成系统，使得酶在每个催化合成步骤都保持高活性，合成500-1000nt长度甚至更长的DNA片段，并将准确率维持在99.5%-99.8%，从而解决长片段DNA合成的难题。

酶促DNA合成技术仍处于起步阶段，但是新技术的出现给高效率、高精度、低成本合成长片段DNA带来了希望，将会对DNA合成技术变来一场技术革命，代表了DNA合成的新的发展方向。DNA尤其是长片段DNA的生物合成如果能够实现，将极大地拓展DNA分子的应用范围，推动合成生物学的进步。

药物递送系统（Drug Delivery System,DDS）是将药物递送到药理作用靶点的系统，涵盖了药物制备、给药途径、位点靶向、代谢和毒理等方面的技术。在临床应用上，药物递送系统不仅发挥着将药物递送到靶点的作用，更重要的是还承担着药物靶向、药物控释、增强药物稳定性或促进药物吸收等多方面的作用，从而解决某些药物溶解度低、靶向效果弱、稳定性差等缺点，提高药物的治疗效果。

新型递送技术的突破和成熟推动了核酸药物的临床转化，撑起核酸药物研发的半边天。由于具有不稳定性、免疫原性、细胞摄取效率低、内吞体逃逸难等多方向的缺点，核酸药物从概念提出到基础研究再到有药物上市经历了较长的历程。对于核酸药物能够实现临床转化，递送系统发挥着至关重要的作用，只有通过递送才使得核酸形式的药物最终成药。目前，成熟的核酸药物递送系统有GalNac（N-乙酰半乳糖胺）偶联修饰、脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）和重组腺相关病毒（recombination adeno-associated virus, rAAV）载体。近些年来，外泌体作为一种新型的递送系统引起了研究人员的广泛关注。

GalNac偶联修饰是当前最常用的小核酸药物递送系统，是核酸药物发展历程中的重大突破。GalNAc能够与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性结合。之后，ASGPR和网格蛋白介导的内吞作用可以将GalNAc转运至肝细胞内。GalNac偶联修饰的小核酸药物提高了小核酸进入肝细胞的效率，解决了小核酸药物靶向性差、脱靶效应严重、稳定性差的缺点，提高了小核酸的临床效果。

但是，该递送系统也存在着一定的局限性，由于ASGPR在肝细胞表面特异性高表达，而在其他组织细胞中表达量极少，因而GalNAc偶联修饰的小核酸药物只能靶向肝细胞并在肝细胞内发挥作用，限制了小核酸药物在其他组织器官中发挥作用。全球已经批准上市3款GalNac偶联修饰siRNA药物，即Givlaari、Leqvio和Oxlumo，均是由Alnylam公司研发，分别用于治疗急性肝卟啉症、高胆固醇血症和原发性高草酸尿症1型。

mRNA新冠疫苗让LNP递送系统声名鹊起。LNP是一种球状的包含脂质成分的实心纳米颗粒。LNP包含有4类分子，分别是可电离的阳离子磷脂、中性辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂。这4种成分按照一定的比例组装成LNP，并在药物递送过程中发挥不同作用。可电离阳离子脂质是药物递送关键因素，在生理pH值下保持中性，降低药物的毒性和免疫原性；在低pH值下带正电，与带负电的RNA结合，并在被细胞内化后实现溶酶体逃逸。中性辅助脂质能够促进层状脂质结构的形成和稳定。胆固醇有较强的膜融合能力，能够促进mRNA的内化和进入胞质。聚乙二醇修饰的磷脂能够改善LNP的亲水性，防止LNP聚集，增加稳定性，并可以避免LNP被免疫系统清除。

新冠疫情促进了mRNA新冠疫苗的获批上市，BioNTech、Moderna和CureVac三家公司的mRNA新冠疫苗均使用了LNP递送技术。在此之前，Alnylam公司基于LNP递送系统研发的siRNA药物Onpattro在美国获批上市，用于治疗肝脏甲状腺素转运蛋白（TTR）介导的淀粉样病变。该核酸药物是一款载有siRNA的LNP，通过静脉输注将药物直接递送至肝脏，通过抑制TTR的合成来发挥治疗作用。

▲图丨LNP的结构示意图 （来源：molecules）

rAAV在基因药物递送上发挥重要作用。rAAV是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体。包裹基因表达系统的rAAV侵入靶细胞后，将包含有基因表达系统的遗传物质通过核孔复合体传递到细胞核内，最终在靶细胞中转录出相应的蛋白发挥治疗作用。rAAV也可以往靶细胞中导入shRNA或者CRISPR-Cas基因编辑系统，从而实现基因沉默或基因编辑功能，达到基因治疗目的。

rAAV具有安全性高、免疫原性低、种类多样等优势，且不同血清型的rAAV具有其独自的组织特异性，可以实现不同组织的基因药物递送。目前，全球共有5款AAV基因治疗药物获批上市（含退市的Glybera）。2022年，2款新的AAV基因治疗药物在欧盟获批上市，极大地推进了rAAV作为递送系统在基因治疗领域的应用。

▲图丨已经获批上市的AAV基因治疗药物 （DeepTech根据公开资料整理）

外泌体有望成为新的核酸药物递送系统。外泌体是由细胞分泌的一种细胞外膜状脂质囊泡，大小在40 -100nm，可以递送核酸、蛋白质、小分子等药物。作为天然内源性转运载体，外泌体具有多种先天优势，如细胞摄取效率高、不激活先天或后天免疫、可以通过血脑屏障传递到中枢神经系统等。正是具有这些先天优势，外泌体作为递送系统被研究用于治疗癌症、心血管疾病、帕金森症和阿尔茨海默病以及其他神经退行性疾病。

目前，外泌体代表公司CODIAK有3款基于工程化外泌体递送系统的创新药物进行1期临床。这3款药物利用工程化外泌体分别携带不同的药物（IL-12、STING激动剂和靶向STAT6转录因子的反义寡核苷酸）靶向至相应的肿瘤组织，激活人体自身的免疫应答以杀伤相应的肿瘤细胞。Evox Therapeutics公司开发了基于外泌体的核酸药物递送系统，递送mRNA、siRNA、反义寡核苷酸以及CRISPR等，用于治疗罕见病和神经系统疾病。