挖掘胚胎心脏发育关键分子，助力先心病微小RNA药物研发

前言

距离全球首例猪心脏移植手术已经过去半年，「顶流」马里兰大学医学院 Dr. Deqiang Li 的研究团队于 2022 年 7 月在 Circulation Research 杂志上发表题目为「Epicardial HDAC3 promotes myocardial growth through a novel microRNA pathway」的心血管文章。该研究揭示了心脏发育中心外膜 HDAC3 通过抑制 miR- 322 /miR- 503 来刺激 Fgf9 和 Igf2 进而促进致密心肌生长，为阐明先天性心脏缺陷的病因和促进心肌再生提供了新的策略和见解。

背景介绍

先天性心脏病 CHD 仍是世界范围内最常见的出生缺陷。肌源性缺陷常与多种形式的冠心病有关。既往的研究集中在确定心肌的内在因素来了解潜在的致病原因，而非心肌细胞的胞间通讯与调控作用被忽视。心外膜和心外膜衍生细胞能够通过旁分泌信号串扰调节相邻致密心肌组织的发育，又通过提供旁分泌生长因子（Fgf9、Igf2）在调节心脏再生中起着关键的枢纽作用。

HDAC（组蛋白去乙酰化酶）3 是一类 HDAC 家族的成员，它可以催化从组蛋白尾部赖氨酸残基中去除乙酰基，并通过调节基因表达参与许多生物学过程。中胚层或全基因敲除 HDAC3 可导致肌源性缺陷和早期胚胎致死，心肌中特异性的 HDAC3 缺失却不会在早期心脏发育中对心脏形态表型产生影响，而是会损害出生后后期的心脏功能。这表明 HDAC3 在非肌细胞室间的功能可能对早期心肌发育至关重要。本研究旨在探寻早期心脏发育过程中，HDAC3 在心外膜中的作用以及 Fgf9 和 Igf2 的表达如何受到 HDACs 或 miRs 的调控。

图. The schematics of the working model

亮点要素

1、发育中的心外膜中 Hdac3 的表达对致密心肌生长至关重要

2、HDAC3 对于心外膜衍生的细胞分化和迁移是很重要的

3、miR- 322 和 miR- 503 抑制 Fgf9 和 Igf2 的转录

4、HDAC3 通过抑制 miR- 322 和 miR- 503 的表达来促进 Fgf9 和 Igf2 的转录

研究内容

01

研究者首先构建了心外膜特异性 Hdac3 敲除鼠 Hdac3eko 以研究心脏发育中 Hdac3 在心外膜中的潜在作用。对敲除 Hdac3 的心外膜进行了谱系追踪。发现 E12.5 -E16.5，epdc（心外膜衍生细胞）发生 EMT 迁移至致密心肌成为成纤维细胞和冠状动脉血管细胞。E14.5 的 eko 心脏迁移至致密心肌的 epdc 比例显著降低，这表明在 Hdac3 缺乏的 epdc 中存在潜在的 EMT 迁移缺陷。心外膜促进胚胎冠状动脉发展，而 eko 心脏中冠状动脉血管细胞标志物 Sox17 阳性细胞明显减少，表明 eko 心脏中冠状动脉发育受损。心外膜和 epdc 通过胞间相互作用促进心肌致密化生长，研究者评估了胚胎期心外膜 Hdac3 缺陷心脏的心肌，E13.5 /E14.5 eko 心脏的致密层明显比对照心脏薄。又对细胞增殖/凋亡是否导致 eko 心室壁发育不良进行验证，E13.5 eko 小鼠致密心肌中 pH3 /Brdu 阳性心肌细胞的百分比与对照心肌相比显著降低，证明心脏发育中心外膜 Hdac3 特异性缺失导致心室壁发育不全。

Figure 1. Epicardial deletion of Hdac3 resulted in hypoplasia of ventricular compact wall.

02

为了进一步探究导致 eko 心脏室壁发育不全表型的潜在分子机制，研究者使用 CRISPR/Cas9 技术，构建了永生化小鼠心外膜细胞（MECs）Hdac3 单克隆敲除株。Hdac3 敲除 MECs 比对照 MECs 生长慢。又对细胞进行批量 RNA 测序和基因本体分析，发现了 1681 个下调基因。GO 通路分析发现，前 14 个显著通路均参与细胞分裂。在分析下调基因中 epdc 分泌的生长因子后，确定 Fgf9 和 Igf2 是目标分子。验证发现 Hdac3 敲除株中 Fgf9 和 Igf2 在 mRNA 和蛋白水平上均降低。体内 eko 心脏中 Fgf9 和 Igf2 也显著降低。提示 Fgf9 和 Igf2 的表达下降与 Hdac3 缺失有关。

Figure 2. Hdac3 deletion resulted in downregulation of Fgf9 and Igf2.

03

研究者试图确定 Fgf9 和 Igf2 的减少是否与心肌细胞增殖减少有关。与对照细胞 EV 相比，Hdac3 敲除株 KO 上清液中 Fgf9 和 Igf2 显著降低。又用细胞上清处理 E13.5 分离的原代胚胎心肌细胞。与 EV 上清相比，KO 上清处理的 pH3 阳性心肌细胞百分比和心肌细胞总数显著降低并且其减弱了心肌细胞增殖下游信号通路 ERK 磷酸化的激活。而在 KO 中补充 Fgf9 和 Igf2 可以修复心肌细胞增殖缺陷并使 p-FGFR1 /p-IGFR1 活化。以上结果表明，来自心外膜细胞分泌的 Fgf9 和 Igf2 提供了驱动心肌细胞增殖的重要线索。

Figure 3. Supplementation of Fgf9 or Igf2 rescues CM proliferation defects.

04

为了确定 HDAC3 是通过去乙酰化酶活性来诱导 Fgf9 和 Igf2 的表达，研究者用选择性 HDAC3 去乙酰化酶抑制剂 RGFP966 处理 MECs，RGFP966 处理显著降低了 Fgf9 和 Igf2。研究者又进行了 Rescue 实验。慢病毒 Hdac3 在敲除株中重表达成功恢复了 Fgf9 和 Igf2 的表达，而去乙酰化酶失活突变慢病毒 Hdac3 的重表达并不能挽救 Fgf9 和 Igf2 的表达。证明 HDAC3 确实是通过去乙酰化酶活性调控 Fgf9 和 Igf2 的表达。

Figure 4. HDAC3 induces the expression of Fgf9 and Igf2 dependent on its deacetylase activity.

05

Fgfs 和 Igfs 的表达可被 miRs 调控，研究者对敲除株进行了 miR 测序。通过差异表达分析及模拟结合位点筛选发现 miR- 322 或 miR- 503 模拟物处理显著抑制 Fgf9 和 Igf2 的表达。通过 Western blot 进一步验证了 miR- 322 mimics/miR- 503 mimics 处理对 Fgf9 和 Igf2 表达的显著抑制作用。又使用 miR- 322 或 miR- 503 模拟物处理培养的 E13.5 心肌细胞，显著降低了 pH3 阳性心肌细胞的百分比，表明 miR- 322 和 miR- 503 抑制心肌细胞增殖。当 HDAC3 的去乙酰化酶活性被 RGFP966 抑制时，miR- 322 和 miR- 503 与敲除株中同样显著上调。体内 E13.5 eko 心脏中也观察到 miR- 322 和 miR- 503 的显著上调。证明了 miR- 322、miR- 503 能够抑制 Fgf9、Igf2 表达和心肌细胞增殖。

Figure 5.miR- 322 and miR- 503 repress the expression of Fgf9 and Igf2 and CM proliferation.

06

为了确定当 Hdac3 被敲除或抑制时，miR- 322 和 miR- 503 的上调对 Fgf9 和 Igf2 的降低有因果影响，使用 miRZip 慢病毒干扰 miR- 322 或 miR- 503 的表达，敲低 miR- 322 或 miR- 503 后可显著恢复敲除株中 Fgf9 和 Igf2 的表达。以上结果表明 HDAC3 通过抑制 miR- 322 和 miR- 503 促进 Fgf9 和 Igf2 的表达。

Figure 6. Knockdown of miR- 322 or miR- 503 restores the expression of Fgf9 and Igf2.

07

H3K27Ac 是活性启动子的标记，也是 HDAC3 的直接下游靶点。Hdac3 缺失导致 MECs 中 H3K27Ac 显著增加。ENCODE 实验发现，miR- 322 /miR- 503 的启动子区域受表观遗传调控。为了确定 Hdac3 缺失是否会影响 miR- 322 /miR- 503 启动子的染色质可及性，研究者通过 ChIP-qPCR 研究了 H3K27Ac 在敲除株中的结合亲和力。发现 Hdac3 缺失显著增加了 H3K27Ac 与 miR- 322 /miR- 503 启动子的结合，这表明 Hdac3 缺失使 miR- 322 /miR- 503 启动子更容易被转录因子接近。为了明确这种染色质可及性的增加是否会影响 miR- 322 /miR- 503 启动子的活性，又进行了 miR- 322 /miR- 503 启动子荧光素酶报告基因实验。发现与对照细胞株相比，敲除株或经 RGFP966 处理后荧光素酶活性显著增加，表明 HDAC3 对 miR- 322 /miR- 503 启动子的调控同样依赖于其去乙酰化酶活性。

Figure 7. HDAC3 represses miR- 322 /miR- 503 promoter activity.

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