进展|糖型解析层面的抗体middle-down质谱分析

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry。本文的通讯作者是罗氏集团的Tilman Schlothauer和Feng Yang。

　　治疗性单克隆抗体(mAb)分析中翻译后修饰(PTMs)的表征是一个主要的挑战，单个PTM通常采用bottom-up的方法进行分析，但PTM之间的关联性信息丢失;middle-down方法提供了分辨率、位点特异性和蛋白型异质性的良好平衡，其表征工作流程主要依赖于末端片段离子。内部片段离子的纳入提高了序列覆盖率和PTM分辨率，使其成为一种有前途的方法。先前，糖工程单克隆抗体的研究表明，一组有限的高甘露糖、乙酰氨基葡萄糖和糖基化蛋白型不同程度地影响了PTMs的敏感性质，如脱酰胺和氧化。Asn 325的脱酰胺是一种功能相关PTM，在传统bottom-up方法中由于其较短的肽段和较高的亲水性而经常被忽略，目前没有研究调查Asn 297糖型对Asn 325脱酰胺敏感性的影响。在这篇文章中，作者提出了一种纳入内部片段的middle-down工作流程，在糖型解析层面上评估mAb上Asn 325脱酰胺修饰。

　　图1. 糖型解析的Asn 325脱酰胺的middle-down分析流程。(A) IdeS酶切后的Fc/2序列，及相关的糖基化(Asn 297)和脱酰胺(Asn 325)位点。(B)工作流程示意图，包括样品制备、RP-LC亚基分离、MS1电荷态选择、四极杆糖型分离、MS2内部片段搜索，以及基于提取的单同位素质量离子色谱(未修饰与修饰)的定量策略。

　　图2. Asn 325脱酰胺鉴定中内部片段SNKAL的定性评价。未修饰(对照)、热应力样品(8w, 40°C)、HC Asn 325 Asp序列突变体的代表性MS2谱图叠加，以及修饰的内部片段离子SDKAL的模拟单同位素质量。*表示未修饰的SNKAL的+1同位素对修饰的SDKAL的单同位素具有足够的分辨率。

　　本研究使用标准IgG1单抗(G1m17, Km3)和突变体(HC Asn 325 Asp)。对于热应激，标准单抗在40°C的配方缓冲液中孵育2、4和8周。在IdeS酶切之前，将10%的突变单抗插入标准单抗中，生成加标样品。抗体经IdeS酶切、还原后，用标准RPLC流程分析(图1B);针对Asn 325脱酰胺位点周围的内部片段离子的覆盖率，作者对HCD碰撞能量和捕获气体参数进行了优化。共分配了覆盖Asn 325的7个内部片段离子，根据片段强度和定量精度，与bottom-up分析确定的目标脱酰胺值相比，选择SNKAL作为Asn 325的代表性特征离子。SNKAL对无应力对照组的特异性通过包含Asp 325的序列突变体(N325D)得到证实，该突变体在未修饰的Asn 325的单同位素质量处没有片段离子(图2)。因此，排除了其他片段离子的中性丢失引起的歧义或重叠。Asn 325对照、Asp 325突变体和分离的糖型(G0F、G1F、G2F)的MS2具有高度可比性。修饰后的单同位素质量和未修饰的Asn 325的第一个同位素之间获得了足够的分辨率(图2)。

　　使用middle-down MS对所有糖型的相对脱酰胺评估与bottom-up分析确定的水平一致(图3)。与热应力持续时间无关，单个糖型(G0F、G1F和G2F)的middle-down脱酰胺评估没有显著差异(图4)。Asp 325突变体的插入实验证实了middle-down策略评估单个糖型脱酰胺水平差异的能力。由于未修饰的Asn 325单抗和Asp 325单抗之间的糖型相对丰度的差异，与总加标量(10%)相比，蛋白型(糖型% ×脱酰胺%)混合的比例不同。因此，在加标样品中，G0F的脱酰胺率低于10%，而由G1F和G2F的脱酰胺率高于10%(图4)。Middle-down脱酰胺评估的精度取决于糖型丰度和脱酰胺水平，单个样本的相对标准偏差范围为2.8%至16.4% (n = 9)，样本间中位相对标准偏差为7.4% (n = 16)。总蛋白型丰度和相对标准偏差显示出明显的相关性，并证明了middle-down方法的敏感性，允许在>0.2%的相对丰度下评估蛋白型。

　　图3. middle-down工作流程对Asn 325脱酰胺定量分析的能力评估。在2w、4w和8w热应力(40°C)下，应力样品bottom-up和middle-down(所有糖型)分析的相关性。数据点表示middle-down分析的技术重复的中位数(n = 9, 3天内重复3次)。误差条显示95%置信区间。CTRL显示n = 3时无应力样品的背景水平。

　　图4. Asn 325脱酰胺的糖型解析水平的middle-down分析。从2w, 4w和8w热应力样品和10% Asp 325加标样品中提取所有糖型和分离糖型(G0F, G1F, G2F)的相对脱酰胺结果。技术重复的中位数和95%置信区间为n = 9时[G2F在2w (n = 4)和4w (n = 8)时除外]。ns =不显著。*表示假定值范围(* < 0.05, **< 0.01, **** < 0.0001)。

　　本文引入了一种新的middle-down策略，通过利用HCD碎片的内部碎片离子来分析单克隆抗体Fc中的PTM动力学，将复杂性降低到Fc/2亚基水平，并保留了相关的蛋白质形态完整性，同时获得了bottom-up方法的分辨率和位点特异性，并成功地证明了IgG1抗体的Fc半乳糖基化变体不会影响热应激下Asn 325脱酰胺的程度。

　　撰稿：夏淑君

　　编辑：李惠琳

　　文章引用：Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry